近期，我校3044am永利集团3044noc吴敬教授团队在橡胶氧化酶Lcp的异源表达方面取得重要进展，研究成果“Enhancing the heterologous expression of latex clearing protein from Streptomyces sp. strain K30 in Escherichia coli through fermentation condition optimization and molecular modification”发表于International Journal of Biological Macromolecules (IF =/info/1021/ /8.2) (https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127995)。
来源于链霉菌Streptomyces sp. strain K30的乳胶清除蛋白(LcpK30)是一种天然的橡胶氧化酶，可以对橡胶(聚异戊二烯)的C=C键进行双加氧裂解。在前期的研究中，吴敬教授团队研究发现橡胶氧化酶LcpK30可以降解经过紫外照射产生了C=C双键的聚乙烯塑料，它在聚烯烃塑料降解方面颇具潜力(Science of The Total Environment, 2022, 806(4), 150779)。但目前LcpK30在工程菌中的表达水平很低，极大地限制了其应用。
吴敬教授团队针对LcpK30在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中可溶性表达差的特点，采用发酵条件优化和酶分子改造联用策略提高了其可溶表达。发酵条件包括诱导条件、辅因子和化学伴侣物质的添加，分子改造采用PROSS服务器预测突变位点而开展。在本研究中，LcpK30最终在0.1 mM的IPTG诱导，辅因子添加终浓度为4 mM的ALA，1 mM的FeSO4，诱导温度25 ℃培养24 h 的优化条件下，发酵酶活达到3.81 U·mL-1。通过添加化学伴侣物质10 mM的甜菜碱，发酵酶活达到5.05 U·mL-1，是原始菌株的237.0%。通过PROSS服务器指导的位点突变，进一步增强了LcpK30目的蛋白的可溶性表达，在13个预测突变体中有8个蛋白表达增加(正向突变率为61.5%)(图1)。随后，通过叠加具有增强效果的蛋白表达和酶活性的单突变体，构建组合突变体。其中三个双突变体G91D/S149A、G91D/A210H和G91D/H296P的表达水平分别为野生型LcpK30的173.3%、173.3%和153.3%。这些突变体还表现出较高的发酵酶活性，分别达到野生型的149.5%、250.0%和420.2%，比活力也有所提高(图2)。相关研究中，化学伴侣物质的添加和分子改造对LcpK30表达最为显著(图3 phaseB和phaseC)。本研究为LcpK30的高效表达提供了参考，并为LcpK30之后的应用研究奠定了基础。
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吴敬教授、王蕾助理研究员为论文的通讯作者，我院2021级硕士生时梦为第一作者，2020级博士生孔德民也参与了部分工作。上述研究得到了国家重点研发计划（2019YFA0706900）、江苏省科技厅政策引导计划-国际合作项目-“一带一路”创新合作项目（No.BZ2020010）等项目资助。
吴敬教授团队长期从事酶基因挖掘、功能优化、发酵制备及应用关键技术的研究，相关成果已发表在Green Chemistry (2022)、Journal of Hazardous Materials (2022)、Bioresource Technology (2023)、Science of The Total Environment (2022)、International Journal of Biological Macromolecules (2022 2023 2024)、Trends in Biotechnology (2023)等本领域权威期刊。
